傳代保存法

        有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì)很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。

        傳代保存時(shí)，培養(yǎng)基的濃度不宜過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長(zhǎng)溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。

        一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行保存，而蕈類(lèi)等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：

①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;

②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;

③反復(fù)傳代時(shí)，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;

④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大;

⑤雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。

        液體石蠟覆蓋保存法

        該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(zhǎng)，適用于霉菌、酵母菌、放線(xiàn)菌及需氧細(xì)菌等的保存。此法可防止干燥，并通過(guò)限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。

        其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門(mén)氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。

        載體保存法

        即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如：

        ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過(guò)篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存。

        ②砂土保存法：取清潔的砂，篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1mL菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預(yù)處理)和一份貧瘠、過(guò)篩的黃土攙和后滅菌，再進(jìn)行菌種保藏。

        ③硅膠保存法：以6～16目的無(wú)色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時(shí)，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。

        ④磁珠保存法：將菌液浸入素?zé)胖?或多孔玻璃珠)后再進(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無(wú)水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對(duì)酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。

        ⑤麩皮保存法：在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，后干燥保藏。

        ⑥紙片(濾紙)保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存。

        懸液保存法

        即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法。常用的方法有：

        ①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線(xiàn)菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。

        ②糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長(zhǎng)達(dá)10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。

        寄主保存法

        即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲(chóng)、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。

        冷凍保存法

        適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無(wú)論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對(duì)菌體造成損傷，當(dāng)采用這種保藏方法時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

        ①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞。

        ②要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異。

        ③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長(zhǎng)。

        ④菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等)。

        ⑤可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑，以防止在冷凍過(guò)程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類(lèi)、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言，不加保護(hù)劑時(shí)更有效。

        ⑥原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。

        ⑦就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲(chóng)則可在-35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍。

        ⑧若進(jìn)行長(zhǎng)期保存，則貯藏溫度越低越好。

        ⑨取用冷凍保存的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來(lái)說(shuō)，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

        常用的冷凍保存法包括：

        ①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：

低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過(guò)多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來(lái)吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。

        ②干冰保存法(-70℃左右)：

即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存；

        ③液氮保存法(-196℃)：

是適用范圍廣的微生物保存法。

其操作步驟如下：

        a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

        b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時(shí)，則不需熔封。

        c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀(guān)察有無(wú)色素進(jìn)入安瓶。

        d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。

        e、速冷：后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

        冷凍干燥保存法

        其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問(wèn)題：　

        a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說(shuō)，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/mL。

        b、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽。

        c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。

        d、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。

        甘油管保藏法

在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。

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