即微生物挑戰(zhàn)性實驗：將一定量的微生物加入到化妝品中，模擬化妝品中可能出現(xiàn)的污染情況，每隔一定時間對其中的活菌量進(jìn)行檢測，以活菌增減量判斷化妝品防腐體系效能的實驗方法。
中和劑(neutralizer)
在微生物殺滅試驗中，用以消除試驗微生物與殺菌劑的混懸液中和微生物表面上殘留的殺菌劑，使其失去對微生物抑制和殺滅作用的試劑。
中和產(chǎn)物(product of neutralization)
指中和劑與殺菌劑作用后的產(chǎn)物。
儀器和設(shè)備
水浴鍋：48℃±2℃。 準(zhǔn)信息平臺
移液器：量程0.5yL~10L； 量程10pL~100uL； 量程100pL~1000piL及無菌吸頭。
無菌吸管，10.0mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸頭。
離心機(jī)：2000g：
顯微鏡：
三角瓶(200mL)：
玻璃試管(18mm×180mm)：
恒溫培養(yǎng)箱：32.5℃±2.5℃22.5℃±2.5℃.
電子天平。
生物安全柜。
計時器。
比濁儀。
渦旋振蕩器。
試劑和材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。
實驗用水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。
磷酸鹽緩沖液(PBS) ：0.03mmol/L， pH 8.0.
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)
Eug on LT 100肉湯
/E中和肉湯(Dey/Engle y中和肉湯)
改良Le the en肉湯。
胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)
試驗菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 6538) 、大腸埃希氏菌(ATCC 25922) 、銅綠假單胞菌(ATCC15442) 、白色假絲酵母菌(ATCC 10231) 、黑曲霉菌(ATCC 16404) 。
操作步驟
菌液制備
白色假絲酵母菌菌液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面，28℃±2℃，培養(yǎng)18-24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，劃線接種于SDA平板， 28*℃±2℃， 電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落， 劃線接種于SDA瓊脂斜面， 28℃±2℃， 培養(yǎng)18-24h， 即為第3代培養(yǎng)物。吸取適量的無菌PBS緩沖液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗， 洗下菌苔.將洗液轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中， 渦旋混勻20s。用PBS緩沖液將其稀釋成約1.0×10°cfu/mL~1.0×10'cfu/mL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用， 或在2℃~8℃保存不超過24h。7.1.2銅綠假單胞菌＼金黃色葡萄球菌＼大腸桿菌菌液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，36℃±1℃，培養(yǎng)18-24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物， 劃線接種于TSA平板， 36℃±1℃℃， 培養(yǎng)18-24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落， 劃線接種于TSA瓊脂斜面， 36℃±1℃℃， 培養(yǎng)18-24h， 即為第3代培養(yǎng)物。吸取適量的無菌生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗，洗下菌苔。將洗液轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中，渦旋混勻20s。用無菌生理鹽水將其稀釋成約1.0x 10'cfu/m~1.0x 10°cfu/mLL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在2℃~8℃保存不超過24h。
黑曲霉孢子懸液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面，22.5℃±2.5℃，培養(yǎng)7d-11d。吸取適量的無菌0.05%(v/v)吐溫
80生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中。將孢子懸液轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無菌三角瓶中， 輕輕振搖1min后， 用無菌玻璃棉過濾除去菌絲。過濾后， 顯微鏡下(400倍) 觀察懸液中是否存在菌絲， 若懸液中有菌絲存在， 可經(jīng)2000g， 離心20min除去菌絲。再次在顯微鏡下觀察， 若仍有菌絲存在， 需再次離心。用無菌0.05%(v/v) 吐溫80生理鹽水將其稀釋成約1.0×10°cfu/mL~1.0X 10°cfu/mL的孢子懸液。制備好的孢子懸液應(yīng)當(dāng)天使用：或在2℃-8℃保存不超過2d， 使用前混合均勻并在顯微鏡下觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。
中和劑鑒定試驗
每種試驗菌株的中和劑鑒定試驗應(yīng)分別進(jìn)行。
化學(xué)中和劑的選擇：為了中和化妝品中的防腐劑， 多采用D/E中和肉湯、Eug on LT 100液體培養(yǎng)基或者改良LE THE EN肉湯。若中和效果不理想， 可根據(jù)產(chǎn)品中添加的防腐劑類型，進(jìn)行選擇。化學(xué)中和劑鑒定流程
將準(zhǔn)備的菌液10倍系列稀釋至濃度為1×10°cfu/mL的菌懸液， 用于中和鑒定試驗。
將1g或1mL樣品加入到9mL中和劑中， *混勻， 室溫作用30±15min， 制成中和產(chǎn)物：若中和效果不理想， 可用中和劑作為稀釋液進(jìn)行二次倍比稀釋。將1mL稀釋液(PBS) 加入到9mL中和劑中， *混勻， 室溫作用30±15min， 作為對照組。
分別接種1mL7.2.3.1中制備的菌液至測試管(含10mL中和產(chǎn)物)和對照管中，渦旋混勻。同時接種1mL 7.2.3.1中制備的菌液至10mL稀釋液(PBS) 中， 作為陽性對照組。
分別對測試組、對照組和陽性對照組進(jìn)行平板計數(shù)，每個稀釋度進(jìn)行雙平行實驗。細(xì)菌培養(yǎng)基為TSA， 36℃±1℃， 培養(yǎng)48h：白色假絲酵母菌培養(yǎng)基為SDA， 28℃±2℃， 培養(yǎng)48-72h。
對各組進(jìn)行計數(shù)， 測試組計數(shù)結(jié)果記作Nvf， 對照組計數(shù)結(jié)果記作Nvn， 陽性對照組計數(shù)結(jié)果記作Nv。當(dāng)Nvn接近Nv， 并且Nvf≥0.5Nvn時， 認(rèn)為中和劑有效。
其余中和方法：除化學(xué)中和劑方法外，還可采用稀釋法、過濾沖洗法對產(chǎn)品中殘留的防腐劑進(jìn)行中和，具體操作方法可參照(消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)2.1.1.4.3。采用稀釋法時，應(yīng)采取適當(dāng)措施補(bǔ)償活菌回收率靈敏度的降低，以避免假陰性結(jié)果(例如，可采用膜過濾計數(shù)法代替稀釋液平板計數(shù)法)。挑戰(zhàn)試驗
挑戰(zhàn)試驗
每種試驗菌株的殺菌試驗應(yīng)分別進(jìn)行。
挑戰(zhàn)試驗前應(yīng)該先按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章第2節(jié)“菌落總數(shù)檢驗方法”對樣品進(jìn)行“菌落總數(shù)”檢測。
接種：取0.2mL7.1中制備的菌液，加入到裝有20g或20mL樣品的無菌塑料瓶中，*混合均勻。接種后的樣品置于22.5℃±2.5℃培養(yǎng)，分別在7，14，28天計數(shù)，分別計作Nx(X=7，14，28)。7.3.4計數(shù)：培養(yǎng)至特定時間后(7，14，21，28天)，取1mL或1g接種后的樣品，加入含有9mL無菌中和劑的試管中，充分渦旋混勻。(若中和劑鑒定試驗中，對樣品進(jìn)行百倍稀釋后測定了中和劑的有效性， 則接種后的樣品進(jìn)行計數(shù)時也應(yīng)進(jìn)行百倍稀釋。) 室溫， 與中和劑作用30±15min后， 分別吸取1.0mL樣液于2個無菌平皿中進(jìn)行平板計數(shù)。如平板上生長菌落數(shù)較多，可進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇合適的稀釋度進(jìn)行平板計數(shù)。每個稀釋度至少進(jìn)行雙平行計數(shù)。黑曲霉菌在22.5℃±2.5℃培養(yǎng)3-5d銅綠假單胞菌＼金黃色葡萄球菌＼大腸桿菌和白色假絲酵母菌在32.5℃±2.5℃培養(yǎng)48-72h。
選取菌落數(shù)在30-300cfu(細(xì)菌和白色假絲酵母菌) 或者15-150cfu(黑曲霉) 的平板進(jìn)行計數(shù)，并按照Nx=C/(Vd)計算樣品中的活菌濃度(C代表計數(shù)平板上的菌落平均數(shù)：V代表計數(shù)平板上的加菌樣品接種量，一般為1mL：d代表計數(shù)平板對應(yīng)的稀釋倍數(shù))。
除大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉外，還可根據(jù)產(chǎn)品具體情況，增加特定的試驗菌，該試驗菌可以代表產(chǎn)品MAX可能受到的生物污染。比如，在高糖分口服制劑(口腔用品) 的防腐挑戰(zhàn)試驗中， 推薦增加魯氏接合酵母N CYC 381。
